L’avvento del sequenziamento dell’RNA unicellulare (scRNA-seq) ha rivoluzionato i campi della medicina e della biologia fornendo la capacità di studiare il funzionamento interno di migliaia di cellule contemporaneamente. Ma i metodi di sequenziamento dell’scRNA sono limitati da potenziali imprecisioni nel determinare la composizione cellulare e l’amplificazione del DNA complementare inefficace (cDNA) – un processo mediante il quale l’RNA a singolo filamento di “complemento” del DNA a doppio filamento viene creato e ripetuto milioni di volte – attraverso una reazione Alter il modello comunemente usato.
Recentemente, un gruppo di ricerca giapponese guidato dal Professore Associato Shigeyuki Shishino e dal Professor Koji Matsushima della Tokyo University of Science, ha sviluppato una nuova e migliorata tecnologia per scRNA-seq. Il nuovo metodo, amplificazione e sequenziamento del cDNA ricotto assistito da Terminator (TAS-Seq), utilizza materiali e apparecchiature semplici per fornire dati scRNA-seq ad alta risoluzione da tecniche esistenti e ampiamente utilizzate. “La nostra tecnologia, TAS-Seq, combina sensibilità di rilevamento genetico, robusta efficienza di interazione e precisione della struttura cellulare per consentirci di acquisire importanti informazioni cellulari”, ha rivelato il professor Shichino. Lo studio è stato pubblicato su Communications Biology il 27 giugno 2022. Il team di ricerca comprendeva anche il professor Satoshi Oha dell’Università delle scienze di Tokyo, il professor Taka Aki Sato dell’Università di Tsukuba e il professor Shinichi Hashimoto della Wakayama Medical University.
TAS-Seq utilizza un enzima indipendente dal modello per amplificare il cDNA chiamato transferasi terminale (TdT). Ma TdT è difficile da affrontare. Per superare questa sfida, il team di ricerca ha incluso il diossinucleotide fosfato (ddNTP) come “terminatore” per la reazione di amplificazione (cDNA). “L’aumento del ddNTP, in particolare della didiocitidina fosfato (ddCTP), interrompe l’eccessivo allungamento della coda della poliN da parte di TdT in modo stocastico e riduce notevolmente le difficoltà tecniche della reazione TdT”, spiega il professore associato Chichino. TAS-Seq utilizza anche la piattaforma scRNA-seq nano/bead, che consente l’isolamento di singole cellule nei campioni di tessuto, riducendo così la distorsione del campionamento cellulare e migliorando l’accuratezza dei dati sulla composizione cellulare. Successivamente, il team di ricerca ha verificato l’efficienza di TAS-Seq e l’ha confrontata con le attuali tecniche ampiamente utilizzate per scRNA-seq, 10X Chromium V2 e Smart-seq2, utilizzando campioni di tessuto polmonare umano e murino. Hanno scoperto che TAS-Seq non solo può rilevare più geni in generale, ma anche identificare più geni altamente variabili, rispetto alle principali piattaforme scRNA-seq. Il Professore Associato Shichino afferma: “Abbiamo scoperto che TAS-Seq può superare 10X Chromium V2 e Smart-seq2 in termini di sensibilità al rilevamento genico e tassi di abbandono genico, suggerendo che TAS-Seq potrebbe essere uno dei metodi scRNA ad alto rendimento più sensibili. Siamo in grado di rilevare i geni in un’ampia gamma di livelli di espressione in modo più coerente e anche di rilevare in modo più robusto i geni del fattore di crescita e dell’interleuchina”.
Un ulteriore vantaggio del nuovo metodo è che TAS-Seq è meno suscettibile agli effetti batch. I dati TAS-Seq erano anche strettamente correlati ai dati della citometria a flusso sui campioni di tessuto, indicando che potevano generare dati sulla composizione cellulare ad alta risoluzione.
Parlando di futuro, rivela il ricercatore Chichino, “Noi abbiamo già realizzazione Sviluppo di TAS-Seq2, una versione migliorata e ampiamente migliorata di TAS-Seq. TAS-Seq2 ha una sensibilità da 1,5 a 2 volte maggiore per il rilevamento genico nelle cellule della milza di topo.Il team di ricerca ha anche fondato ImmunoGenetics, una società di investimento della Tokyo University of Science, per fornire servizi scRNA-seq utilizzando TAS-Seq e TAS-Seq2.
scRNA-seq è uno strumento importante per i ricercatori medici e biologici. Lo sviluppo di TAS-Seq e TAS-Seq2 porterà alla scoperta di nuovi bersagli terapeutici per malattie e progressi nel campo della “trascrizione spaziale”, che dipende anche dalla sintesi di cDNA in fase solida. Accelererà inoltre lo sviluppo della tecnologia omica unicellulare, migliorando così la nostra comprensione dei principi della biologia e dell’evoluzione e della progressione della malattia.
video: https://youtu.be/B803lwsiu9w
Fonte della storia:
Materiali Introduzione di Università delle scienze di Tokyo. Nota: il contenuto può essere modificato in base allo stile e alla lunghezza.
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